RNA病毒扩拉检测的质控品和标准品研究进展|CATO标准品信息网

　　RNA病毒如丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺点病毒（HIV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）等的核酸检测对于传染的初期诊断和抗病毒医治疗效的动态察看存在主要价值。自1983年发现聚合酶链反映（PCR）手艺以来，呈现了基因扩增的概念。今朝多采取核酸扩增手艺（NAT）检测病毒RNA，最经常使用的是逆转录（RT）-PCR方式。核酸扩增检测想到靠得住的成果，必需利用质控品进行严酷的质量节制，而对病毒进行定量测定，凡是还需须有病毒RNA尺度品。今朝RNA病毒扩增检测的质控品的尺度品分为两大类，一是袒露的RNA片断，二是内含特定RNA的病毒样颗粒或称之为带盔甲的RNA（armored RNA）。
　　1、袒露的RNA
　　袒露的RNA即没有任何卵白包裹的RNA片断。其凡是将特定的RNA病毒拟扩增RNA的cDNA经体外转录体例进行构建后，获得1种与响应cDNA互补的RNA（cRNA）。cRNA的构建方式根基上是起首将所需的RNA逆转录为cDNA，再经PCR 分散后，产品DNA片断经T载体克隆人响应的质粒载体，而后再构建人含T7启动子的载体，体外逆转录获得响应的cRNA[1-5]。这类袒露的RNA便可作为响应RNA RT-PCR测定的质控品和定量尺度品。
　　袒露的RNA构建方式简略，可在吸光度260nm波长下比色进行精确定量。其错误谬误是：（1）不变性差，能于保留[1-3]。cRNA片断完整表露于外界情况中，很轻易被情况中的核糖核酸酶（RNase）所降解。（2）cRNA由响应模板DNA逆转录发生，原有模板DNA的传染很难经由过程加DNase消化去除[5]。（3）不克不及监测样本中的RNA病毒颗粒的裂解效力。cRNA直接表露于样本溶液中，没法摹拟和监测真正病毒颗粒的核酸提取进程[1-5]。因为上述缘由，cRNA质控品和尺度品很难在临床RNA病毒RT-PCR检测中现实利用，今朝仅限于一些文献报导[1-5]。
　　2、内含特定RNA的病毒样颗粒
　　已知某些RNA病毒如MS2噬菌体、烟草花叶病毒（TMV）的外壳可以耐受RNase的感化，是以，如将特定的RNA序列包裹到这些病毒外壳内，便可以使其免受情况中RNase的降解。同时，在利用进程中还可以摹拟病毒颗粒监测核酸提取进程中的病毒裂解效力。
　　1．包裹于MS2噬菌体包膜卵白内的RNA
　　MS2呼噬菌体属于正极性单链RNA球形病毒，基因组全长3659bp，有编码成熟酶卵白、包膜卵白、复制酶卵白和裂解卵白等4种卵白质份子。噬菌体由180包膜卵白单体、一份子成熟酶卵白和一份子基因组RNA构成，在较初期的大肠杆菌病毒—MS2噬菌体包膜卵白的研讨中，发明包膜卵白与把持子RNA序列有特异性彼此感化，这类感化可在激发噬菌体外壳组装的同时，将噬菌体基因组RNA包装到包膜内。是以，若是将特定病毒RNA的cDAN克隆地MS2噬菌体包膜卵白基因序列cDAN下流，并在其下流拔出终止子，转录后获得带有噬菌体把持子RNA序列的特定病毒RNA转录本，随后把持子RNA序列便可以激发噬菌体包膜卵白组装外壳，并将携带有特定病毒RNA序列的部门噬菌体基因组包装到包膜内，组成噬菌体病毒样颗粒。
　　要构建质粒表白载体时，需将噬菌体成熟酶卵白、包膜卵白基因序列cDNA克隆表白于表白载体启动子下流，经引诱表白后，所表白的包膜卵白不但可用为病毒样颗粒的布局万分，还可作为基因表白调理因子和pac旌旗灯号对表白进程进行调理，使包膜卵白的表白和RNA转录调和一致，组装所得噬菌体样颗粒有成熟特征，从而存在RNase抗性[6，7]。
　　国外及我们的研讨[8-13]将编码MS2噬菌体响应卵白的cDNA序列毗连到表白载体，如Pet28b T7 启动子下流，颠末引诱表白获得成熟酶卵白和包膜卵白，在成熟酶以及噬菌体基因组RNA片断的协同感化下，组装获得耐RNase的特征[12]。我们将HCV RNA[13]、HIV RNA和SARS-CoV RNA等的cDNA序列构建于该质粒载体中的MS2噬菌体19000基因组下流，经转化细菌表白后，便可获得存在耐RNase特征的内含特定RNA的病毒样颗粒。今朝，我们还完成了构建肿瘤标记物，如前列腺特异抗原（PSA）和甲胎卵白（AFP）的mRNA病毒样颗粒的表白载体，因为p1NCCL表白载体的通用性，可以预感其在触及RNA尺度品和质控品的研制中将存在极其广漠的利用远景。
　　2．包裹于烟草花叶病毒（TMV）包膜卵白内的RNA
　　将特定的病毒RNA序列的cDAN与烟草花叶病毒（TMV）的包膜基因序列cDAN一路克隆接到表白载体，也可引诱表白包膜卵白并组装成病毒颗粒[14]。在引诱表白进程中，外源基因表白产品可伴同组装的TMV颗粒一路构成，又要注重引入外源基因序列的位点，如许可以确保病毒基因组引发包膜卵白的组装，并使组装的颗粒存在成熟特笥，即RNase抗性，同时，应确保引入的外源基因序列不会在重组进程中产生丧失现象。
利用内含特定RNA的病毒样颗粒或带盔甲的RNA做为RNA病毒RT-PCR检测的质控品的尺度品，存在下述长处：（1）无生物沾染危险性。（2）作为RNA RT-PCR检测的尺度品和质控品存在很好的不变性。（3）在核酸提取中，对病原体内RNA有很好的摹拟感化。因为表白产品为噬菌体样颗粒，存在很好的病毒颗粒摹拟功效。是以，在核酸提取进程中，与标本中真正病毒核酸的提取进程有很好的类似性。
　　另外，也有人利用牛腹泻病毒（BVDV）作为检测HCV的内部尺度品[15]，或者用HCV病毒颗粒作为检测HCV RNA的尺度品取代世界卫生组织供给的HCV尺度品[16]，或者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA尺度品，可是，这些手艺没法降服病毒颗粒沾染性、病毒颗粒制备、运输坚苦等题目，也就是说病毒颗粒不是抱负的尺度品。
　　综上所述，在RNA病毒RT-PCR检测中，影响实验进程的身分较多，照实验职员测定操纵中的随机误差、扩增仪孔间温度的差别、标本核酸提取后按捺物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效力及试剂的题目等，这些身分都可能会影响PCR扩增的效力，进而造成成果的误差。是以，PCR测定必需利用质控品进行严酷的室内质量节制才干包管成果的靠得住性，另外，进行定量测定，必需有定量的尺度品或内标，内标还可起到单管即时质控的感化。一个不变靠得住，且无生物沾染危险性的RNA质控品和尺度品，对于包管RNA病毒的RT-PCR检测质量存在主要意义。在这一点上，袒露的RNA病毒颗粒及病毒替换品均难以作为抱负的质控品的尺度品，而采取份子克隆和原核表白方式构建的内含特定病毒RNA片断的噬菌体病毒颗粒则能较好的解决这些题目，其不单对于RNA病毒RT-PCR检测的尺度化，并且对于特定的mRNA的检测等均有着潜伏的利用价值。